人类遗传病患者的正常和有缺陷的候选基因的功能，已被人类遗传学家和整个生物医学界越来越多的发现，将在相关的和预测性模型生物中进行机制的研究，以便对它们进行高速验证和分析。发育，细胞和分子机制，以及建立疾病模型以便进行治疗选择。我们描述和讨论青蛙Xenopus的优缺点，青蛙在过去已被广泛用于发育机制研究，但远未被生物医学模型充分利用。我们认为，非洲爪蟾补充了更常用的小鼠和斑马鱼，作为一种节省时间和成本的动物模型，用于研究人类疾病的等位基因和机制。
介绍
早期研究两栖动物胚胎学的研究人员从野外收集标本。但是，当时条件局限于无法控制的环境参数，例如春季的天气，两栖动物在池塘和水坑中产卵。青蛙非洲爪蟾于年代初在英国首次作为胚胎实验室动物出现，当时它首次引起了动物学家的注意，他们发现它们可以在水族馆中繁殖。它的名声发生在年代和年代，当时通过将孕妇的尿液注入雌性青蛙的皮下进行妊娠试验：如果存在促性腺激素，雌性会产卵。年代初，非洲爪蟾青蛙进入了发育生物学研究领域。毫无疑问，这一时期最著名的实验是约翰·古登（JohnGurdon）对体细胞核全能性的证明。Gurdon通过核移植将第一个脊椎动物克隆到了无核受精卵合子中，这一实验在约54年后的年获得了诺贝尔奖。在20世纪的最后30年中，非洲爪蟾在很多实验室中得到了广泛的应用，许多基本的细胞生物学和发育概念都源于青蛙胚胎的研究，最重要的是细胞周期的分子调控，这是对许多关键分子的首次鉴定。脊椎动物发育基因，包括在施佩曼组织者中表达的基因，以及许多信号传导途径的基础，最主要的是Wnt和BMP信号传导。因此，非洲爪蟾作为脊椎动物发育机制的典型生物模型的价值和多功能性已得到证实，从未引起过争论。
但是，在评估人类疾病等位基因时，大多数临床医生和人类遗传学家会转向老鼠和斑马鱼，它们被认为是研究人类疾病机制的真正的模型生物。两者都从一开始就被确立为遗传模型，而非洲爪蟾（以及一般的两栖动物）作为实验模型表现出色。然而，随着二倍体热带爪蟾作为实验室动物的发展，热带爪蟾和热带爪蟾基因组的完整测序，以及Xenopus基因组编辑的到来已成为遗传模型生物家族的一员。美国和欧洲资源中心已经提供了许多转基因品系（Xenbase.org;xenopusresource.org），并且可以相当快地产生新的品系。人类遗传疾病的候选基因和等位基因正在以惊人的速度被发现：诸如全基因组关联研究，GWAS，全外显子测序，WES以及来自健康和患病组织的DNA和RNA测序等分析产生了大量候选基因以及等位基因，他们需要以可控的成本快速评估大型数据集。
当然，每个模型系统都有其优点和局限性。例如，作为哺乳动物的小鼠的基因组与人类非常相似，并且具有可用于基因操作的巨大工具箱。但是，小鼠模型需要在动物饲养和维护上进行昂贵的投资，产仔数很小，平均只有8个后代，其中只有一小部分携带突变等位基因，而且对突变小鼠的分析非常耗时。斑马鱼产生大量后代，饲养成本较低，并具有完善的遗传方法和许多可用的突变体和报告基因。然而，硬骨基因组重复导致许多生物医学相关基因的亚功能化，与哺乳动物相比，其同义性丧失。直接观察胚胎发育甚至进行活细胞成像的可能性已在斑马鱼中得到了广泛的成功。但是，这不是斑马鱼的独特功能。例如，肾脏的发育和神经细胞的迁移已经直接在活蛙胚胎中以很高的时间和空间分辨率成像了。斑马鱼还具有某些特定于器官的限制。例如，他们无法模拟影响四肢或手指，肺或横膜的人类综合症，这些综合症涉及许多人类先天性综合症但不存在于鱼类中。此外，尽管斑马鱼心脏是研究再生的绝佳模型，仅具有一个心房和一个心室的模型无法完全模拟人类四腔心脏的畸形。青蛙如下所述，非洲爪蟾具有巨大的潜力来补充更成熟的小鼠和斑马鱼，从而极大地增强人类疾病预测动物模型的功能。这篇综述描述了非洲爪蟾的许多实验属性，这些属性使得能够对候选基因进行详细研究，目的是提醒临床科学家和人类遗传学家这种已建立且仍很重要的动物模型的潜力。
非洲爪蟾如今，有两种蛙类被用于研究，一种已经使用了数十年的非洲爪蟾Xlaevis和最近才在许多实验室中引入的热带蛙XTropicalis。热带爪蟾是遗传上的二倍体物种，在24–26°C的温度下繁殖，而Xlaevis较喜欢在18°C的较冷水域进行繁殖，是两个物种经过杂交的产物，即包含重复的一组基因和染色体。当然，作为两栖动物的青蛙在基因上与人类距离较远，但它们具有共同的四足动物血统，在进化时间上比骨鱼类更近。完整的基因组测序和对这两个物种的仔细注释揭示了与人类的惊人高度一致性。即使在Xlaevis的重复基因组中，由于两组染色体不交叉，重复副本的亚功能化程度也较低。两种非洲爪蟾中近90％的人类疾病基因均具有同源基因物种，序列保守性通常很高，这是任何预测性动物模型的前提。许多实验室并行使用两种物种，即使用Xtropicis进行基因组编辑，并使用Xlaevis进行大多数其他研究。
该模型的主要特征是在过去获得了极大的吸引力，并为将来的使用提供了广阔的前景。它具有获得卵母细胞和胚胎的便利性：雌性爪蟾一次可以产下成千上万个卵，而荷尔蒙引发可诱导产卵;如今，研究人员利用了使青蛙成为妊娠测试系统的相同原理。可以通过自然交配或通过从睾丸中添加精子人工使卵受精，在Xlaevis的情况下，可以将其在冰箱中保存数天而不会失去受精能力。另外，卵母细胞很大，在Xlaevis和Xtropicis中直径分别为12和8mm。当细胞变得太小以至于不能轻易地靶向时，这允许容易地将细胞内显微注射到合子或早期发育阶段的限定卵裂球中，直至大约64细胞阶段。此外，单个细胞的谱系是众所周知的。也就是说，注射可以在发育后期，变态之前，非常精确地针对组织和器官，这是在发育5天后达到的，器官形成基本完成（图1）。因此，可以在发育的最初几个小时的早期切割阶段进行精确的操作，并在整个器官发育的后续几天连续跟踪其后果。因此，可以操纵大量的胚胎，这些胚胎非常迅速地发育到器官发生的所需阶段，从而有可能在短时间内获得结果。由于雌性每年会产下许多高质量的卵，并且饲养费用相对便宜，因此与老鼠相比，动物的成本要低得多。
图1.从受精卵到5天大的蝌蚪的Xlaevis胚胎发育。指出了左右不对称，肾脏，脑室和皮肤纤毛分化的发育阶段，时间和关键时间点。比例尺，μm。
如今，在用于评估人类遗传病的任何其他动物模型中都没有发现的独特功能是单侧注射的可能性，这意味着仅对一侧的胚胎进行操作，而对侧则作为内部对照（图2）。该属性是第一次分裂将胚胎的左侧和右侧分开的结果，在评估实验操作的表型后果非常重要，因为有时野生型基因表达的差异可能很大。每个实验处理大量胚胎的能力以及基于对照侧正常发育选择标本进行分析的可能性，为每个研究增加了较高的严格性，统计学意义和可重复性。
图2.精确定位到正在发育的非洲爪蟾胚胎的左侧和右侧。将绿色和红色荧光染料分别在4细胞阶段注入左卵裂球和右卵裂球中（左图和第二幅照片）。这种分离在整个发育过程中持续存在，如卵裂分裂末期的囊胚期胚胎，神经胚和极体。这允许单侧操作，即未操作侧可以用作内部对照。比例尺，μm。
至少在胚胎发育的前三分之一，大尺寸的卵母细胞和胚胎将非洲爪蟾蛙与斑马鱼和小鼠区分开来，这提供了另一个独特的优势：足够的材料可以用可管理的标本数量进行蛋白质组学分析。随着蛋白质组学的飞速发展，这一特性必将在不久的将来变得更加突出，例如可以对野生型和突变型蛋白进行比较性相互作用研究。最后一个值得一提的特征是，对于许多不认识青蛙的人来说，这是出乎意料的：有干细胞，它们可以很容易地分化成特定的组织和器官（图3）。这些幼稚的细胞可以很容易地在卵裂分裂结束时从胚中切除，然后开始进行分化成指定胚层。它们位于动物极点，即远离重力矢量的极点。分离出的所谓动物帽在培养皿中培养时会分化成未定义的非典型外胚层样细胞。但是，添加或注射确定的生长因子，转录因子或其他诱导剂（例如视黄酸）会将这些细胞转化为各种组织，无论是肾脏，心脏还是胰腺（图3）。另外，可以研究形态发生运动，因为外植体可能会经历所谓的会聚扩展，即由于细胞插层引起的伸长（图3），该过程受非经典Wnt信号的控制，与许多人类疾病有关。
图3.外植体培养系统研究形态发生运动（趋同延伸）。左：所谓的Keller外植体，其中包含Spemann的组织区，因此在文化中延伸（延伸和融合）。在该系统中，可以通过在4细胞阶段将例如mRNA注入该区域并在胃造口开始时移出来研究和操纵非经典Wnt信号传导。正确：动物帽外植体可以通过注射或与诱导剂培养而分化为胰腺，心脏和肾脏组织，以及研究者可以选择的其他选择。
当使用青蛙模型时，细胞内显微注射是最重要的技术。设置非常简单：解剖显微镜配有灵活的光源和固定和引导注射针的装置。在任何给定的一天可以注射数百个胚胎。大多数实验室都有许多注射装置，需要在30-45分钟左右的有限时间窗口内注射。在许多情况下，操纵与基因表达有关。反义吗啉代寡聚物（MO），即具有吗啉代环而不是核糖或脱氧核糖的单链核苷酸链，如果它们在起始AUG处结合（翻译阻断型MOs或TBMOs），则与mRNA结合并干扰翻译。当它们覆盖剪接供体或受体位点时（剪接阻断）。通常通过共同注入示踪剂（例如荧光右旋糖酐或膜靶向的GFP）来监视对目标组织或器官的正确靶向，这些示踪剂允许人们仅通过在显微镜下观察就可以丢弃错误靶向的标本。当然，必须小心地控制MO的特异性，因为脱靶效应不能被事先排除在外，就像所有需要与特定核苷酸序列（无论是基因组还是在RNA水平）相互作用的操作一样。对照包括使用一种以上的MO，剂量依赖性和通过共注入MO不能靶向的拯救mRNA表型。关于基因和mRNA靶向特异性的争论由来已久，应该提醒每个研究者在解释特定结果时要保持批判和谨慎。非洲爪蟾通过CRISPR/Cas9技术进行基因组编辑很容易，并且可以用来验证MO的使用，并可以作为一种有效的遗传工具而自用。关于候选人类疾病基因和等位基因的分析，两种技术均成功使用（见下文）。然而，基因的相互作用对于研究疾病的分子机制至关重要，而使用MOs则可以轻松地对其进行研究：为所讨论的两个或三个基因选择剂量，本身不会导致发育的任何表型改变。联合注射产生的缺陷证明了果蝇遗传相互作用。另外，表型效应的给药还提供了规避早期胚胎致死率的优点，因此可以研究处于发育阶段的基因，在该阶段尚无相应的突变体可用于分析。许多人类先天综合症是由杂合子亚型等位基因的组合引起的，因此与遗传无效等位基因相比，通过降低蛋白质水平可以更好地进行研究。此外，只需显微注射突变mRNA，即可在非洲爪蟾胚胎中轻松表达突变人等位基因。通过这种方式，可以在野生型胚胎或通过反义MO敲除内源基因的标本中对疾病等位基因进行功能评估。
非洲爪蟾对研究人类畸形和疾病的适用性在过去的十年左右的时间里，非洲爪蟾国际组织的白癜风可以治疗吗北京看白癜风哪间医院比较好
